jenabioscience:生物素蛋白標記試劑盒——蛋白質生物素化試劑盒

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業客戶開發創新試劑。

供一般實驗室使用。

運輸:凝膠包裝運輸

儲存條件:儲存在-20°C
避免冷凍/解凍循環

保質期:12個月

描述:
親和素、鏈霉親和素或NeutrAvidin與生物素的結合是已知*強的生物相互作用，解離常數在10范圍內-15米（meter的縮寫））
維生素生物素可以與許多蛋白質結合，而不會因生物素分子的小尺寸而喪失其生物活性。生物素化探針通常由抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或NeutrAvidin檢測，攜帶報告基團，例如辣根過氧化物酶(HRP)或熒光標記。
感興趣的蛋白質(POI)通常在不同的位置被生物素化。每個結合的生物素結合一個抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或NeutrAvidin分子，導致信號放大。
生物素和生物素結合蛋白之間的相互作用用于各種應用，如親和層析、熒光激活細胞分選(FACS)、ELISA和蛋白質印跡。
該蛋白質生物素化試劑盒包含對5毫克POI進行5次單獨標記反應所需的所有試劑。

內容:
生物素NHS-酯
5瓶，每瓶含1毫克

二甲基甲酰胺
500微升

碳酸氫鈉
1瓶含168毫克

超純水
2毫升

儲存和穩定性:
收到后，將生物素儲存在-20°c下。其他成分可儲存在室溫下。如果按照建議儲存，Jena Bioscience保證該產品在12個月內保持最佳性能。

協議:
一般注意事項
蛋白質濃度應該至少為2 mg/ml，更高的濃度-高達10 mg/ml -是優選的，因為低濃度會影響標記效率。我們建議每個標記反應使用大約5毫克蛋白質。
含有伯胺如Tris和甘氨酸的緩沖液不適用于標記反應，必須在開始標記反應前用合適的不含胺的緩沖液如PBS、MES或HEPES替換。

實驗協議

• 加入2 ml超純水溶解碳酸氫鈉。得到的1 M溶液在4°C下至少穩定2周。
• 向蛋白質溶液中加入適量的碳酸氫鈉(1 M ),使最終濃度達到100 mM
• 從冰箱中取出一個生物素小瓶，并在打開前將其平衡至室溫。通過添加100 μl DMF制備生物素，使濃度達到10 mg/ml。渦旋直至生物素*全溶解！在使用前準備好溶液！
• 將500 μl蛋白質溶液(10 mg/ml)和溶解的生物素加入適當的小瓶中。小心渦旋并短暫離心，收集試管底部的反應混合物。
• 室溫下在搖床中培養一小時。
• 使用標準凝膠過濾柱如Sephadex G-25或類似物純化綴合物?；蛘?，游離生物素可以通過透析或適當的旋轉濃縮器從綴合物中分離出來。

  
  請注意，該套件不提供蛋白質純化材料！

• 用SDS-PAGE分析你的結合物。

結合物的儲存
像未標記的蛋白質一樣儲存結合物。我們建議將溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷凍。避免反復冷凍和解凍！

故障排除:
低生物素化效率

• 蛋白質溶液的濃度

  
  

  該分析被優化用于標記濃度為10 mg/ml的5 mg蛋白質。

  
  

  生物素化的效率強烈依賴于濃度，并且在不同的蛋白質之間有所不同。因此，在每一種情況下，優化可能是獲得最佳生物素化所必需的。
• 緩沖成分

  
  

  含有伯胺(甚至微量)的蛋白質溶液會顯著降低生物素化效率。確保你的蛋白質被充分透析，以防它與含胺物質接觸。
• pH值的影響

  
  

  檢查你的蛋白質溶液的pH值！參考范圍是8.2 - 8.5。

  
  

  蛋白質的伯氨基不能被質子化而具有活性，因此，蛋白質溶液的pH值必須足夠高。另一方面，NHS酯的水解速率隨著溶液pH值的增加而增加，從而產生非反應性生物素。最佳生物素化結果已在pH 8.3獲得。

  
  

  在pH值較低的強緩沖蛋白質溶液中，100 mM碳酸氫鈉可能不足以將pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氫鈉，直到達到最佳pH值。

請注意，生物素化效率不僅取決于環境條件，還取決于蛋白質特性。蛋白質表面的三級結構和由此產生的賴氨酸數量以及等電點和蛋白質在pH 8.3下的行為起作用。

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