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      hellobio免疫組織化學 (IHC) 實驗組織準備

      更新時間:2024-02-26      點擊次數:605

      高質量的組織制備對于高質量的免疫組織化學結果絕對必要,因此始終值得花時間確保按照盡可能高的標準進行,以避免令人失望的結果。根據實驗要求,組織可能需要新鮮使用或固定。

       

      1 冷凍組織以供后續處理

      有時需要在進一步處理或隨后的固定之前冷凍組織。如果冷凍不當,可能會形成冰晶,損害細胞結構。通過正確冷凍,這將保持組織的質量,從而最大限度地提高免疫染色成功的機會。

      1. 將裝有異戊烷的燒杯(長燒杯中至少 500ml)在 -80°C 中或使用干冰預冷至 -42°C 至 -45°C 之間。定期監測溫度以確保溫度保持在這個范圍內。

      2. 在冰上使用干凈的工具解剖組織。

      3. 將紙巾放在鋁箔上,并用濾紙除去多余的液體。

      4. 將組織(不含鋁箔)輕輕浸入異戊烷中。冷凍所需時間取決于組織樣本大小,但冷凍成年大鼠大腦大約需要 5 分鐘。

      5. 在從異戊烷中取出組織之前,預冷鑷子。將冷凍組織放入裝有軟紙巾的預冷管中。

      6. 儲存于-80°C 直至下次使用。

      2 灌注固定

      一般來說,當動物被灌注固定時,可以獲得最佳質量的組織切片。該過程涉及先用緩沖液然后用固定劑替換血液,并且其具有高自發熒光。在嘗試之前,請確保您的監管制度涵蓋了這一點,并獲得經驗豐富的從業人員的培訓。針對嚙齒類動物的一般方案是:

      1. 通過適當途徑過量注射麻醉劑,直至動物沒有腳趾捏和眨眼反射但心臟仍在跳動。

      2. 打開胸腔,露出心臟,剪斷右心房。將針插入左心室,并通過冰冷的 PBS(大鼠約 200ml,小鼠約 15ml)灌注,然后灌注類似體積的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。

      3. 取出大腦/其他器官,放入裝有 4% 多聚甲醛的小瓶中,在 4°C 下放置 24 小時。

      4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中,直至組織沉入小瓶底部

      3 浸入固定

      對于小體積的組織,通常用固定劑孵育組織就足夠了,而不是使用灌注固定。然而,這將導致較高的背景,因為血液不會從小毛細血管中去除。

      1. 在冰上用干凈的工具解剖組織。

      2. 用冰冷的 PBS 短暫清洗

      3. 將組織放入含 4% 多聚甲醛的 PBS 中,4°C 下放置 24 小時

      4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中,直至組織沉入小瓶底部

      4 切片

      可以在一系列機器上切割切片,最常見的是低溫恒溫器和冷凍切片機。機器的選擇部分取決于可用性,部分取決于需要切割多厚的部分。檢查可用機器的規格是否與所需的截面厚度相匹配。

      對于載玻片免疫組織化學,切片可以直接切割到顯微鏡載玻片上,或者切割到 PBS 中,用于自由浮動免疫組織化學。

      切割后,切片可以冷凍以供日后處理:

      • 載玻片安裝:讓切片干燥后,切片可在 -20°C 至 -80°C 下保存長達一年

      • 自由浮動 將切片轉移至冷凍保護劑中,然后在 -20°C 下保存長達一年。


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