抗體驗證的*策略：封閉肽驗證

據報道，每年因劣質抗體造成的生物和醫(yī)學研究損失約為8億美元。此外，實驗結果不一致和抗體重復性差的后果 是無法估計的。

國際抗體驗證工作組（IWGAV）于2016年9月發(fā)表題為《 自然方法 中 抗體驗證的建議》的文章 ，強調抗體驗證應根據目標蛋白的相應應用和背景進行。作者提出了抗體驗證的五個概念支柱：（i）遺傳策略，（ii）正交策略，（iii）獨立抗體策略，（iv）標記蛋白的表達，以及（v）免疫捕獲后進行質譜分析。多發(fā)性硬化癥）。

這五種方法各有其優(yōu)缺點以及適用條件。例如，遺傳策略通過比較細胞或組織中的相關信號來評估抗體特異性，其中使用 CRISPR-Cas9 或 RNA 干擾 (RNAi) 敲除或敲低目標基因與野生型 (WT) 對照的信號。盡管這種方法很簡單，但未能擊倒或敲除目標基因將大大損害該方法的實驗可行性。

免疫捕獲后進行質譜 (MS) 的方法可以識別與純化抗體直接相互作用的蛋白質， 以及與目標蛋白質間接相互作用的其他蛋白質。 然而，這種方法依賴于昂貴的科學儀器和實驗材料。并非每個實驗室都能負擔得起這些設備。

在 Affinity Biotech，抗體通過 獨立抗體驗證進行驗證。為此，使用幾種抗體來識別靶蛋白上的不同表位。具有最高特異性的抗體是通過包括比較和定量分析的適當程序確定的。雖然大多數抗體的檢測應該沒有問題，但對于檢測特異性要求較高的抗體，特別是那些位點特異性的磷酸化抗體，仍然不夠。

結合多年的抗體研發(fā)和生產經驗，Affinity Biotech采用了更合適的抗體驗證策略： 封閉 肽驗證。

封閉肽(抗原)與抗體一一對應。 。這是最原始的材料，只有原廠才能提供。

首先，我們對封閉肽進行 MS 分析，以確保肽序列準確。

在蛋白質印跡分析中，肽會阻斷目標抗體的信號。沒有封閉肽的泳道用作對照。封閉肽將與靶蛋白競爭結合位點，從而在封閉基團中不留下特異性條帶。

該策略目前用于驗證我們的抗體。它對于磷抗體的生產至關重要，因為它確保了磷抗體的位點特異性。換句話說，磷酸化抗體只能識別相應位點的磷酸化靶蛋白。非磷酸化的目標蛋白或其他位點磷酸化的目標蛋白將不會被識別。

舉個例子。在 Phospho-MSK1 (Ser211) Antibody（貨號 AF7155）的蛋白質印跡驗證中，泳道 1 和泳道 3 中分別添加了非磷酸化阻斷肽和磷酸化阻斷肽。 2號車道沒有被封閉。結果顯示，使用磷酸化肽封閉目標蛋白后，沒有檢測到目的條帶。