金納米顆粒綴合物已廣泛應(yīng)用于生物研究和生物傳感應(yīng)用。例如，金納米顆粒可以用作光學(xué)或電子顯微鏡、側(cè)流免疫測(cè)定和免疫印跡方案（例如斑點(diǎn)印跡和蛋白質(zhì)印跡）中的探針。 

制備金綴合物有兩種方法，即被動(dòng)吸附和通過(guò)連接體的共價(jià)偶聯(lián)。盡管制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但蛋白質(zhì)對(duì)金納米顆粒的被動(dòng)吸附并不能提供涂層的附著，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，分子可能會(huì)從表面解吸。此外，在某些情況下，蛋白質(zhì)在吸附到表面后會(huì)失去其特性，這可能是由于三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化或活性位點(diǎn)/抗原結(jié)合位點(diǎn)與金表面的結(jié)合使其難以接近而引起的。

盡管存在這些缺點(diǎn)，蛋白質(zhì)被動(dòng)吸附到金納米顆粒上仍然很受歡迎，并且是生成蛋白質(zhì)金綴合物的簡(jiǎn)單方法。通過(guò)被動(dòng)吸附到標(biāo)準(zhǔn)球形金納米粒子來(lái)制備金納米粒子蛋白綴合物，可以使用我們方便的被動(dòng)吸附金綴合優(yōu)化套件進(jìn)行優(yōu)化。

與被動(dòng)吸附相比，共價(jià)偶聯(lián)將感興趣的分子固定在功能化金納米顆粒上（例如帶有NHS、羧基或胺基團(tuán)）。與被動(dòng)吸附方法相比，這種方法大大提高了蛋白質(zhì)涂層的穩(wěn)定性。共價(jià)偶聯(lián)使用與待綴合分子上的特定化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)接頭。因此，該方法比被動(dòng)吸附方法更具特異性和可控性，并且可以針對(duì)特定應(yīng)用優(yōu)化共價(jià)綴合配體的數(shù)量。通過(guò)接頭的共價(jià)偶聯(lián)還具有最小化空間位阻和對(duì)綴合蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響的優(yōu)點(diǎn)。總而言之，這對(duì)綴合蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生的有害影響較小。 

我們的羧基金納米粒子、羧基金納米海膽和羧基金納米棒均依賴于 EDC/NHS 化學(xué)進(jìn)行結(jié)合。 EDC 和 NHS“激活"顆粒表面的羧基，形成中間體，隨后與特定蛋白質(zhì)或其他待綴合配體上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)。EDC 綴合的效率通常較低，并且對(duì) pH 值和共價(jià)鍵敏感耦合協(xié)議需要一定程度的優(yōu)化才能實(shí)現(xiàn)所需的性能或穩(wěn)定性。 

以下方案提供了將生物分子與我們的羧化金納米顆粒偶聯(lián)的一般指南，以標(biāo)準(zhǔn) IgG 與我們的 20 nm 羧基金納米顆粒的偶聯(lián)為例。對(duì)于其他生物分子或納米粒子類型的綴合，最佳綴合條件可能會(huì)有所不同。為了獲得與顆粒表面的最大結(jié)合，用于結(jié)合的蛋白質(zhì)的量比全覆蓋所需的理論量多大約1至10倍。 

所需材料和設(shè)備

• 20nm羧基金納米粒子 

• 甲基金納米粒子（陰性對(duì)照）

• 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)（Sigma，目錄號(hào) E1769）

• N-羥基磺基琥珀酰亞胺 (Sulfo-NHS)（Sigma，目錄號(hào) 56485）

• 陽(yáng)性對(duì)照蛋白：辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 或來(lái)自人血清的 IgG（Sigma，目錄號(hào) I4506）

• 阻斷劑：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma，目錄號(hào) A3059）

• 激活緩沖液：2-(N-嗎啉代)乙磺酸 (MES) 緩沖液（10 mM，pH 5.5）

• 偶聯(lián)緩沖液：1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)

• 洗滌緩沖液：1X 磷酸鹽緩沖鹽水 + 0.05% Tween 20 (PBST)

• 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)

• 待綴合的目標(biāo)蛋白

注意：待綴合的蛋白質(zhì)必須是純凈的且不含污染蛋白質(zhì)（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能與待綴合的蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，并可能導(dǎo)致綴合效率顯著降低。該蛋白質(zhì)還應(yīng)該具有足夠的可接近的伯胺基團(tuán)用于綴合。賴氨酸殘基是 EDC 綴合的主要靶位點(diǎn)。 

程序

1. 如果金納米粒子的濃度低于OD 50，則通過(guò)離心濃縮它們。如果緩沖液中有顆粒，則通過(guò)離心在純水中清洗它們。有關(guān)說(shuō)明，請(qǐng)參閱“金納米顆粒處理和儲(chǔ)存"。

2. 在 MES 緩沖液中制備濃度分別為 30 和 36 mg/mL 的新鮮 EDC/NHS 混合溶液。請(qǐng)注意，EDC/NHS 在水溶液中會(huì)迅速水解，應(yīng)在結(jié)合前新鮮制備。

3. 取 10 µL 20 nm 金納米粒子（水中 OD 50）并與步驟 2 中制備的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。

4. 室溫孵育 30 分鐘

5. 添加 1 mL PBST 并渦旋 

6. 6,500 g 離心 30 分鐘

7. 除去大部分上清液

8. 添加 10 µL 抗體（1 X PBS 中 1 mg/mL）*

9. 在水浴超聲儀中超聲 10 秒

10. 室溫下攪拌孵育 2 至 4 小時(shí)

11. 添加 1 mL PBST 并渦旋

12. 6,500 g 離心 30 分鐘

13. 除去大部分上清液

14. 添加 50 µL PBS 和 1% BSA

15. 儲(chǔ)存于 4 度即可使用

* 蛋白質(zhì)的濃度可能會(huì)根據(jù)顆粒大小和要結(jié)合的蛋白質(zhì)而變化。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的量應(yīng)比全表面覆蓋的量多 1 至 10 倍。應(yīng)估計(jì)顆粒的總表面積和對(duì)接面積，以計(jì)算最佳的蛋白質(zhì)含量。下表是將 IgG 與不同尺寸的羧基金顆粒結(jié)合的一般參考。其他蛋白質(zhì)的計(jì)算類似，但需要計(jì)算您感興趣的蛋白質(zhì)的對(duì)接面積。

表 I.  EDC 綴合期間不同尺寸的羧基金納米顆粒的 IgG 的建議量。 IgG 分子的對(duì)接面積估計(jì)為 45 nm2。 “NX全覆蓋量"是指孵育量與顆粒表面全覆蓋所需量之間的過(guò)量比。