DNA 標記方案——點擊寡核苷酸和 DNA 的化學標記

點擊化學是一種多功能反應，可用于合成各種綴合物。事實上，任何生物分子都可以使用點擊化學方法輕松地用小分子標記，例如熒光染料、生物素等。

點擊化學反應發生在兩種組分之間： 疊氮化物和炔烴（末端乙炔）。疊氮基和炔基在天然生物分子中幾乎從未遇到過。因此，該反應具有高度生物正交性和特異性。如果需要標記寡 核苷酸，可以在許多定制寡核苷酸合成設施和公司訂購炔烴修飾的寡核苷酸。

1. 使用下表計算點擊化學標記所需的試劑體積。準備所需的儲備溶液（見附錄）。

   試劑	混合物中的最終濃度	原液濃度
   炔烴修飾寡核苷酸	變化（20 — 200 uM）	各不相同
   疊氮化物	1.5 x（寡核苷酸濃度）	10 mM DMSO 溶液
   二甲基亞砜	50體積％	—
   抗壞血酸	0.5毫米	5 mM 水中
   銅-TBTA絡合物	0.5毫米	10 mM，溶于 55 vol% DMSO

2. 將炔烴修飾的寡核苷酸或 DNA溶解在耐壓小瓶中的水中。

3. 添加2M 醋酸三乙銨緩沖液（pH 7.0）至終濃度 0.2 M。

4. 添加DMSO，并渦旋。

5. 添加疊氮化物儲備溶液（DMSO 中的 10 mM），并渦旋。

6. 將所需體積的 5mM 抗壞血酸儲備溶液添加到混合物中，并短暫渦旋。

7. 通過向其中鼓泡惰性氣體 30 秒來對溶液進行脫氣。可以使用氮氣、氬氣或氦氣。

8. 將所需量的 10 mM 銅 (II)-TBTA 庫存在 55% DMSO 中添加到混合物中。用惰性氣體沖洗小瓶并蓋上蓋子。

9. 渦旋混合物。如果觀察到明顯的疊氮化物沉淀，則將小瓶在 80°C 下加熱 3 分鐘，然后渦旋。

10. 在室溫下保存過夜。

11. 用丙酮（對于寡核苷酸）或乙醇（對于 DNA）沉淀結合物。

    沉淀寡核苷酸綴合物：

    向混合物中添加至少 4 倍過量體積的 3% 高氯酸鋰丙酮溶液（如果混合物體積很大，則分成幾個小瓶）。

    沉淀 DNA 綴合物：

    向混合物中添加乙酸鈉至終濃度0.3M；

    添加 2.5 體積的乙醇（或 0.8 體積的異丙醇）。

    充分混合并在-20°C下保持20分鐘。

12. 10000 rpm 離心 10 分鐘。

13. 丟棄上清液。

14. 用丙酮 (1 mL) 洗滌沉淀，以 10000 rpm 離心 10 分鐘。

15. 棄去上清液，干燥沉淀，并通過 RP-HPLC 或 PAGE 純化綴合物。