什么是 dTAG？

dTAG（降解 TAG）是一種創(chuàng)新型靶標確認方法，該方法使用異雙功能小分子降解劑來調控細胞的蛋白降解系統以及清除目標蛋白。dTAG 系統由 Dana Farber 癌癥中心的 Behnam Nabet 博士及其同事共同開發(fā)，是一種可被廣泛推廣的方法，也是一種靶蛋白降解 (TPD)的方式。在開發(fā)降解劑的過程中，PROTAC ®  MZ 1（類別號 6154）和 THAL SNS 032（類別號 6532）等其他 TPD 方法使用一種已與 E3 連接酶配體相連的靶蛋白的已知配體。dTAG 技術通過降解劑技術和基因組工程的結合，從而消除了對已知配體的需要。

dTAG 是如何工作的？

圖 1：dTAG 的作用機理

通過CRISPR/Cas9 介導的基因座特異性敲入或慢病毒轉基因表達，靶蛋白表達為一種具有 FKBP12F36V 突變體的嵌合體。dTAG-13（類別號 6605）等 dTAG 化合物由一個高選擇性 FKBP12F36V 配體與 E3 連接酶配體連接組成，該配體在融合蛋白和 E3 連接酶之間形成一個三元復合體，從而引起靶蛋白多聚泛素化和降解。

在體外，dTAG-13 經證實會導致 BRD4-FKBP12F36V 的快速有效降解，但對內源性野生型 FKBP12、BRD2 或 BRD3 水平沒有影響。為驗證此方法，還將 dTAG 系統用于與 EZH2、HDAC1、KRAS、MYC 和 PLK1 融合的 FKBP12F36V 的蛋白嵌合體。還使用一種熒光素酶-FKBP12F36V 嵌合體在體內對 dTAG-13 的療效進行了驗證。這種融合蛋白最初在一種人白血病細胞系中表達，隨后被移植到小鼠骨髓中。dTAG-13 會導致生物發(fā)光信號迅速減少，這表明其能有效降解熒光素酶-FKBP12F36V 嵌合體。

dTAG 在癌癥中用于靶標確認

常規(guī)的靶標確認策略包括使用RNA 干擾 (RNAi) 或 CRISPR/Cas9破壞基因表達從而導致細胞總蛋白水平降低 ，或使用小分子拮抗劑抑制蛋白功能。小分子等藥理學方法較單純的基因方法具有許多優(yōu)勢，包括劑量依賴性效應以及快速且可逆的作用。相比之下，基因方法提供的動態(tài)控制較少、無法確定效應量且通常不可逆。使用 dTAG 進行靶標確認結合了基因和藥理學策略的關鍵優(yōu)勢，能對細胞總蛋白豐度提供快速的劑量依賴性效應，而且這種效應在降解劑洗脫方面是可逆的。

dTAG-13 已被用來檢測和驗證癌癥的新靶點。含有 YEATS 結構域的蛋白 ENL 是超級延伸復合體 (SEC) 的一部分，該復合體可通過增加 RNA 聚合酶在轉錄期間的催化速率來控制轉錄延伸級別的基因活動。該蛋白先前已被確定為急性髓系白血病 (AML) 中的一種關鍵蛋白，可通過維持基因表達失調來支持發(fā)病機制，然而，并無已知可用于 ENL 的配體。

為驗證 ENL 作為 AML 中的一種靶標，Erb 等人將 ENL 表達為人體 AML 細胞系中的一種 FKBP12F36V 融合蛋白并在納摩爾濃度下通過 dTAG-13 證實了 ENL 的選擇性降解。這導致了轉錄起始和延伸的全基因組抑制以及細胞生長停滯。使用 dTAG-13 降解 ENL 的進一步研究表明其在 SEC 募集中發(fā)揮作用，并將 YEATS 結構域確定為一種對 ENL 依賴性細胞生長至關重要的染色質識別域的效應分子。