Nanogold® 偶聯(lián)物分離方法

將凝膠過濾作為分離 Nanogold® 結(jié)合物的方法：這是我們實驗室的常規(guī)使用方法，并且該方法已得到很好的表征。 Nanogold® 的分子量接近 15,000，但由于其中很大一部分是由非常致密的金原子組成的，因此在許多基于大小的分離技術(shù)（例如凝膠過濾）中，Nanogold 的表現(xiàn)就好像其 MW 更接近大約 8,000。

在計劃您的標(biāo)記反應(yīng)時，您應(yīng)該使用過量的成分，根據(jù)尺寸更容易與 Nanogold® 標(biāo)記的產(chǎn)品分離。如果您的分子小于 Nanogold®，您應(yīng)該使用過量的較小分子進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)（對于稍小的分子，大約 5 倍過量是一個很好的起點(diǎn)，對于小得多的分子，10 倍到 20 倍是一個很好的起點(diǎn)分子），因為從反應(yīng)混合物中分離過量的小分子比分離過量的大分子更容易。

如果您要標(biāo)記大于約 10,000 MW 的分子，您應(yīng)該使用過量的 Nanogold®，因為現(xiàn)在它比過量的未反應(yīng)生物分子更容易與偶聯(lián)物分離。對于大多數(shù)反應(yīng)，兩倍到五倍的過量是合適的。

凝膠過濾介質(zhì)及其分離特性的列表在我們的 偶聯(lián)物分離指南.

已經(jīng)嘗試了其他色譜方法，但迄今為止尚未給出可重現(xiàn)的結(jié)果。一種對十金有一定成功的方法是疏水相互作用色譜法，這種方法對十®金來說似乎很有希望。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可用于從納米金偶聯(lián)物中分離較大和較小的雜質(zhì);pocedure基于Hainfeld描述的undecagold，undecagold-Fab'共軛物和unlabelfab'的分離：

應(yīng)該注意的是，使用的技術(shù)是疏水作用色譜，而不是反相;該方法依賴于離子強(qiáng)度遞減的梯度，其中不同的固定化分子以不同的離子強(qiáng)度脫落。對于十一金和納米金實驗，都使用了丁基衍生化凝膠;還嘗試了聯(lián)苯衍生化凝膠，但丁基凝膠給出的結(jié)果最好。

使用三到六柱體積的梯度進(jìn)行分離。將偶聯(lián)物溶解在2.0 M硫酸銨中，使用乙酸三乙基銨（5 mM）將pH調(diào)節(jié)至中性值（7或7.5）。用于梯度的兩個緩沖區(qū)是： （A）2M硫酸銨，使用三乙基乙酸銨（5mM）將pH調(diào)節(jié)至中性值（6.5，7或7.5）。 （B） 5 mM 三乙基乙酸銨，pH 7 或 7.5。 樣品進(jìn)樣后，運(yùn)行一體積的緩沖液A，然后在梯度上，緩沖液B的比例從0穩(wěn)定增加到100%，然后用緩沖液B繼續(xù)洗脫.使用該梯度，首先洗脫未偶聯(lián)的Fab'，然后洗脫Nanogold-Fab'，然后是未連接的Nanogold。

我們不推薦將凝膠電泳作為純化方法，因為 Nanogold® 顆粒在凝膠中的遷移是不可預(yù)測的，并且結(jié)合物的鑒定并不簡單。透析的結(jié)果好壞參半；然而，應(yīng)謹(jǐn)慎行事，因為某些膜含有可降解 Nanogold® 的成分。