轉(zhuǎn)染試劑的比較：siRNA 和 DNA

介紹

體外 轉(zhuǎn)染過程 涉及將遺傳物質(zhì)引入細胞，通常通過非病毒方法用于哺乳動物細胞 [1]。各種治療性貨物分子可用于細胞內(nèi)遞送至癌細胞系和原代細胞，包括質(zhì)粒 DNA (pDNA)、蛋白質(zhì)、小分子、信使 RNA (mRNA) 和RNA，例如短干擾 RNA ( siRNA ) 和微小 RNA (miRNA) ) [2]。Altogen Biosystems 通過將組合化學(xué)、分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)方面的專業(yè)知識應(yīng)用于轉(zhuǎn)染技術(shù)的開發(fā)，為特定細胞系開發(fā)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

自 1950 年代以來，轉(zhuǎn)染一直在使用，并且仍然是細胞生物學(xué)研究中的重要元素，其技術(shù)范圍從物理技術(shù)（如電穿孔）到使用磷酸鈣的化學(xué)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，甚至脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù) [3]。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，遺傳物質(zhì)包含在脂質(zhì)體中通過將材料與陽離子脂質(zhì)混合，脂質(zhì)體將其“貨物"沉積到靶細胞中。可以針對目標(biāo)細胞系優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑，也可以定制轉(zhuǎn)染方案。最近出現(xiàn)了幾種先進的方法，例如基于脂質(zhì)和聚合物的載體分子。這些化合物能夠產(chǎn)生脂質(zhì)體，脂質(zhì)體可以與細胞膜融合，以便將結(jié)合的 RNA 或 DNA 遞送至細胞。

轉(zhuǎn)染：作用機制

體外 轉(zhuǎn)染是將外源分子和遺傳物質(zhì)、DNA或 RNA 瞬時或穩(wěn)定地引入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中。盡管轉(zhuǎn)染技術(shù)存在方法學(xué)多樣性，但化學(xué)轉(zhuǎn)染是當(dāng)前實驗室研究中使用的技術(shù)。使用的轉(zhuǎn)染試劑含有陽離子脂質(zhì)，有助于將 DNA 和 siRNA 遞送到細胞中 [4]；雖然陽離子聚合物是最早使用的化學(xué)品之一，但陽離子脂質(zhì)現(xiàn)在是當(dāng)今使用廣泛的化學(xué)品。化學(xué)轉(zhuǎn)染背后的科學(xué)原理保持不變，它基于載貨分子與細胞膜脂質(zhì)雙層之間的靜電相互作用. 基本上，帶負電荷的遺傳物質(zhì)與帶正電荷的試劑結(jié)合，使遺傳物質(zhì)能夠穿過細胞膜，從而通過內(nèi)吞作用發(fā)生細胞攝取。在細胞內(nèi)部，轉(zhuǎn)染復(fù)合物可用于多種目的。如果 DNA 被轉(zhuǎn)染，則穩(wěn)定表達需要它進入細胞核，從而導(dǎo)致基因表達 [5]。可能影響特定化學(xué)選擇的因素取決于轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)，但 pH 值、細胞類型以及遺傳物質(zhì)與試劑的比例等因素對于正確的實驗設(shè)置至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)染方法

將 DNA 和 RNA 引入培養(yǎng)的哺乳動物細胞可能需要不同的轉(zhuǎn)染方法，具體取決于特定的細胞系和最終目標(biāo)。此類方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑（脂質(zhì)和聚合物）、基于樹枝狀聚合物的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、病毒介導(dǎo)的基因遞送、RNA 干擾 (RNAi)、siRNA 轉(zhuǎn)染、高通量 siRNA 篩選和基因沉默 (RNAi) [6, 7, 8]。

轉(zhuǎn)染試劑

對于化學(xué)轉(zhuǎn)染實驗來說，保持細胞活力極為重要；如果細胞因用于轉(zhuǎn)染的有毒化學(xué)品而死亡，則實驗結(jié)束。轉(zhuǎn)染試劑之所以眾多，正是因為某些細胞類型需要更溫和的條件或特殊添加劑來防止細胞毒性。就此而言，Altogen Biosystems 提供了專為特定細胞系設(shè)計的種類齊全的試劑，專門設(shè)計用于提高轉(zhuǎn)染效率，同時防止細胞死亡。

轉(zhuǎn)染試劑本身由專門針對特定細胞類型優(yōu)化的緩沖液配方組成。在某些情況下，轉(zhuǎn)染試劑可包括旨在幫助所需化合物進入細胞的分子。例如，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將包括脂質(zhì)體鏈，其封裝給定的核酸序列并允許其被細胞內(nèi)吞。另一個例子是用納米粒子制成的轉(zhuǎn)染試劑，它可以結(jié)合所需的序列并幫助它們穿過細胞膜。

與所需貨物結(jié)合的轉(zhuǎn)染試劑和影響細胞膜的轉(zhuǎn)染試劑之間應(yīng)該有一個重要的區(qū)別。例如，電穿孔緩沖液是一種轉(zhuǎn)染試劑，它允許細胞膜變得可滲透，從而允許外來顆粒進入細胞。然而，電穿孔緩沖液不封裝核酸序列，因此電穿孔實驗必須依賴轉(zhuǎn)染化合物的獨立穩(wěn)定性。

體外 轉(zhuǎn)染研究

Altogen Biosystems 提供針對不同細胞系優(yōu)化的不同體外轉(zhuǎn)染試劑，例如 A549 細胞（肺癌）、DU145 細胞（前列腺癌）、MCF-7 細胞（乳腺癌）和 HepG2 細胞（肝細胞癌）。以下是使用  細胞系特異性體外轉(zhuǎn)染試劑進行的幾項研究的數(shù)據(jù)匯編。

A549細胞轉(zhuǎn)染試劑（肺癌細胞，CCL-185）

圖 1.按照推薦方案轉(zhuǎn)染靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA。在轉(zhuǎn)染后 48 小時，通過 qRT-PCR 分析 A549 細胞的基因表達水平。18S rRNA 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 雙組分制劑提高了脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率，

• 為 RNA 和 DNA 的轉(zhuǎn)染提供了優(yōu)化的易于使用的轉(zhuǎn)染方案

• 血清存在下的高轉(zhuǎn)染效率

• 適用于標(biāo)準(zhǔn)反向轉(zhuǎn)染和高通量應(yīng)用。

• 試劑表現(xiàn)出至少 80% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率通過實時RT-PCR確定。

圖 2. Lamin A/C 在 A549 細胞中的蛋白質(zhì)表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 A549 細胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細胞的蛋白質(zhì)表達水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細胞用作陰性對照。

DU145 細胞（前列腺癌細胞，HTB-81）轉(zhuǎn)染試劑

圖 3.按照推薦方案將靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA 轉(zhuǎn)染到 DU-145 細胞中。在轉(zhuǎn)染后 48 小時，通過 qRT-PCR 分析細胞的 Lamin A/C 基因表達水平。18S rRNA 水平用于標(biāo)準(zhǔn)化 Lamin A/C 數(shù)據(jù)。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=4)。

• 專有陽離子脂質(zhì)配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率

• 產(chǎn)生一致的結(jié)果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細胞系的試劑

• 優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案適用于標(biāo)準(zhǔn)和反向轉(zhuǎn)染方法。

• 有效且穩(wěn)健的細胞內(nèi)遞送

• 試劑盒包括轉(zhuǎn)染增強劑試劑

• 在血清存在下工作

• 試劑表現(xiàn)出至少 75% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。

圖 4. Lamin A/C 在 DU145 細胞中的蛋白質(zhì)表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 DU145 細胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細胞的蛋白質(zhì)表達水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細胞用作陰性對照。

MCF-7細胞轉(zhuǎn)染試劑（乳腺癌細胞，HTB-22）

圖 5 。在用靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 轉(zhuǎn)染的 MCF-7 細胞中，使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行量化。轉(zhuǎn)染后 48 小時，收獲細胞并通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進行標(biāo)準(zhǔn)化。對照樣品是模擬轉(zhuǎn)染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 專有陽離子脂質(zhì)配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率

• 產(chǎn)生一致的結(jié)果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細胞系的試劑

• 試劑表現(xiàn)出至少 85% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。

圖 6. MCF-7 細胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 MCF-7 細胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細胞的蛋白質(zhì)表達水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細胞用作陰性對照。

HepG2細胞轉(zhuǎn)染試劑（肝癌細胞，HB-8065）

圖 7.在轉(zhuǎn)染了靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 的 HepG2 細胞中，使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行了定量。轉(zhuǎn)染后 48 小時，收獲細胞并通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數(shù)據(jù)針對 18S rRNA 信號進行標(biāo)準(zhǔn)化。對照樣品是模擬轉(zhuǎn)染的或未處理的。將值歸一化為未處理的樣品。數(shù)據(jù)為平均值±SD (n=3)。

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉(zhuǎn)染效率

• 有效且穩(wěn)健的細胞內(nèi)遞送

• 產(chǎn)生一致的結(jié)果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經(jīng)過驗證的用于建立穩(wěn)定細胞系的試劑

• 試劑表現(xiàn)出至少 90% 的 siRNA 轉(zhuǎn)染效率。通過 qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染效率。

圖 8. HepG2 細胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosystems 轉(zhuǎn)染方案，將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 HepG2 細胞中。在轉(zhuǎn)染后 72 小時，通過蛋白質(zhì)印跡分析細胞的蛋白質(zhì)表達水平（通過總蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化，每孔加載 10 µg 總蛋白質(zhì)）。未處理的細胞用作陰性對照。

結(jié)論：

轉(zhuǎn)染是一項經(jīng)過充分測試且至關(guān)重要的生物技術(shù)，它使研究人員能夠直接在細胞中研究基因產(chǎn)物和基因功能。不同的轉(zhuǎn)染方法允許以非常特定的方式傳遞遺傳物質(zhì)，從而使其成為臨床前生物學(xué)研究中極其通用的工具。選擇最佳方法涉及實施最佳轉(zhuǎn)染試劑，以及選擇最佳實驗設(shè)計。

Altogen Biosystems 提供預(yù)優(yōu)化和細胞系特異性體外轉(zhuǎn)染試劑和試劑盒。在他們的網(wǎng)站上了解更多關(guān)于這些轉(zhuǎn)染試劑和試劑盒的信息，并加快您今天的臨床前生物學(xué)研究。